尊龙凯时-人生就是博的细胞培养手册：大鼠肺泡巨噬细胞NR8383培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：大鼠肺泡巨噬细胞NR8383
生长特性：贴壁型和悬浮型混合生长
冻存条件：使用无血清冻存液（货号：C7001）
培养体系：F12K培养基 + 20%胎牛血清 + 1%青霉素/链霉素（P/S）
传代方法：建议第一次按1:2的比例进行传代，每2天换液一次。
备注：悬浮细胞需离心收集，而贴壁细胞则应按其特性处理，使用无菌离心管收集培养基以便后续过渡培养。

二、细胞处理和培养

收到细胞后，待细胞恢复良好后，将完全培养液灌满并密封瓶口，是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，使用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，然后在超净工作台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置于37℃，5% CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，随后可进行后续处理。通过显微镜观察细胞的生长情况，并进行不同倍数的拍照保存（最佳选择40x、100x和200x，各一张），前三天的照片为重要售后依据，若未提供照片则默认收到状态良好。在传代后，建议使用原瓶培育的完全培养基对比新配制的培养基，以便进行进一步的观察和比较。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

在细胞未超过80%汇合度时，可以将培养液收集至离心管中，保留5ml培养基放入37℃，5% CO2的培养箱继续培养；若细胞密度超出80%，则应进行传代。
对于贴壁细胞，传代步骤如下：
1. 去除培养基，用无钙镁PBS冲洗细胞1-2次。
2. 加入0.25%胰蛋白酶消化液1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞变化，如有大部分细胞变圆并开始脱落，立即加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞直至全部脱落后吸出，然后转移至15ml离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 按1:2比例将细胞悬液分配至两个T25瓶中，并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃，5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
对于悬浮细胞，传代步骤如下：
方法一：收集细胞，1000 RPM下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后轻轻混匀，再按1:2的比例分瓶至新的含8ml完全培养基的瓶中。
方法二：选择半数换液，弃去一半培养基后尽量避免扰动细胞，将剩余细胞用培养基悬起，并按1:2的比例分配至新的培养瓶中。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液并用PBS一次性清洗细胞。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞变化，待细胞回缩并变圆后，加入5ml完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞使之完全脱落，转移至15ml离心管中并以1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞立即放入-80℃冰箱内，若后续需要转入液氮罐，需在-80℃下放置超过24小时后再进行转换。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（请注意防护），快速将其置于37℃水浴中解冻，直至无结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟。
3. 弃去上清并用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并放于37℃，5% CO2的细胞培养箱继续培养；次日更换为新鲜的完全培养基。

四、注意事项

注意某些细胞贴壁不牢，运输过程中可能会发生细胞脱落，这是正常现象。若脱落较多，可将培养瓶中的培养液收集至离心管，进行离心并收集上清作过渡培养，之后如需对比培养，再次加入胰酶进行细胞处理。

五、售后条款

1）细胞出现问题的重发情况包括：
- 在运输过程中因各种原因，如细胞丢失、瓶身破损、培养液泄漏导致的问题。
- 细胞污染问题需在收到产品48小时内提供真实实验结果以核实。
- 常温发货的细胞静置24小时或干冰运输的细胞复苏后未存活需提供照片以验证。
- 若细胞状态在接收后48小时内发生变化且有明确记录的操作步骤，则视为我方责任。
若经技术人员判定为双方责任，将依合同的50%收费标准处理。
2）出现问题不予重发的情况包括：
- 客户造成的细胞污染。
- 不当操作造成细胞状态不良。
- 非推荐的细胞培养体系导致细胞状态不佳。
- 未提供培养前3天的照片等。

尊龙凯时-人生就是博致力于提供高质量的细胞培养服务，并期待为您解答更多相关问题。