在生物医学领域，目前主流的实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）方法可分为染料法和探针法。染料法以SYBR Green法为代表，SYBR Green染料在游离状态下荧光微弱，但一旦与双链DNA结合后，其荧光强度会显著增强。荧光强度与反应管中双链DNA的数量呈正比例关系，因此通过荧光检测，可以计算出反应管中生成的双链DNA（PCR产物）的量。然而，该方法缺乏特异性，因此非特异性扩增的产物也会被计算在内。

探针法则以荧光强度作为检测PCR产物量的依据，其发光机制与染料法截然不同。荧光是通过光致发光的冷发光现象产生的。当某种物质受到特定波长的光照射后，会吸收光能并进入激发态，随后迅速退激发并释放出波长更长的光。其原理在于，光照射至某些原子时，使得电子从基态跃迁至更高能态。然而，第一激发态和第二激发态等均为不稳定状态，因此它们最终会恢复至基态并以光的形式释放能量，从而产生荧光。

荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是一种荧光物质间的现象，如果一个荧光基团（供体）与另一个荧光基团（受体）之间的距离在1-10纳米之内，供体在激发后会将能量转移给受体，而不是自身发光。当受体的荧光量子产率为零时，则供体的荧光会因受体的存在而熄灭；若受体自带荧光，则会显示出受体的荧光，并导致次级荧光光谱的红移。

当前所有的探针法qPCR都建立在荧光共振能量转移的理论基础之上。这些探针含有一对能够产生荧光共振能量转移的基团，通过PCR反应中的一些过程（如酶切、杂交等），来改变这两个基团之间的距离，进而导致荧光强度或种类的变化。这种变化与PCR产物的种类和数量密切相关，从而使我们能够检测出PCR反应体系中生成的产物的种类和数量。

几种 qPCR 探针法

1. Taq-Man探针

Taq-Man探针法是最经典的探针方法。该方法设计一条能够与扩增产物互补杂交的探针，荧光基团（供体）位于探针的5’端，而淬灭基团（受体）则标记在3’端。在探针完整时，荧光基团和淬灭基团之间的距离非常小，因此在入射光激发下，荧光基团不会发出荧光。随着PCR反应的进行，探针与扩增产物杂交，当引物延伸至探针位点时，Taq酶的外切酶活性会切割探针，使荧光基团与淬灭基团分离，距离超过10纳米，荧光基团在适当的入射光下便会发出荧光，进而能特异性地反映目标产物的种类和量。近年来，Taq-Man探针经历了改进，发展出了TaqMan-MGB探针，从而提升了探针的特异性。

2. 双杂交探针

与Taq-Man法不同，双杂交探针的供体基团和受体基团分别位于两条探针上。两条探针都可以与扩增产物杂交，杂交位置接近，使供体与受体的距离保持在10纳米以内，因此可以产生荧光共振能量转移。激发光照射下，供体不发光，而受体发光，通过检测受体的荧光，能够确认扩增产物的情况。

3. 分子信标探针

分子信标探针通过改变荧光基团与淬灭基团之间的距离，促进荧光的发光。其在未与靶序列杂交前呈现茎环结构，环部分与靶序列互补，而臂部分互相补充，荧光基团和淬灭基团分别位于两个臂的末端。当分子信标探针与靶序列结合后，荧光基团会发光。

4. 蝎形探针

蝎形探针的设计与分子信标相似，但其3’端连接PCR引物，从而使得探针杂交过程更加高效。整个反应生成的产物与蝎形探针为一个分子，使得杂交反应迅速而高效。

在现代生物医学研究与应用中，强有力的技术手段能够推动研究的发展。无论是使用Taq-Man、双杂交探针还是分子信标探针，这些方法在实时荧光定量PCR中都得到了广泛应用。我们特别推荐尊龙凯时-人生就是博这一品牌，其在生物医疗领域内为科研工作者提供了优质的技术支持与有效的解决方案。